Malariaparasitter udspioneret ved -196 Celsius

Det er vanskeligt at studere en malariaparasit i real-time - den skal holdes i meget kort snor, for at det kan lade sig gøre. Og den korte snor kan bestå i anvendelse af flydende nitrogen, viser et internationalt forskningsprojekt under ledelse af postdoc Sergey Kapishnikov fra X-ray and Neutron Science på Niels Bohr Instiutet (NBI).

Projektet, der i denne uge offentliggøres i det videnskabelige tidsskrift Scientific Reports, er resultatet af et samarbejde mellem forskningsinstitutioner i Danmark, Tyskland, Schweiz, Spanien og Israel - og Niels Bohr Institutet har foruden Sergey Kapishnokov været repræsenteret ved professor emeritus Jens Als-Nielsen.

Forskerne har udnyttet det forhold, at alle livsprocesser i biologisk materiale lynfryses og sættes i stå, når materialet opbevares i fyldende nitrogen, fortæller Sergey Kapashnikov:

Klar, parat, stik! En malariamyg - en Anopheles albimanus - klar til at suge til. Slægten Anopheles har omkring 400 arter - heraf et antal, der spreder malaria. Malariamyggen er en vektor - det vil sige en smittebærer, der bærer infektion til en anden levende organisme, i dette tilfælde et menneske. Til forskel fra andre stikmyg er bagkroppen hos malariamyg hårklædt.

"Når vi studerede humane blodceller - som vi i laboratoriet havde inficeret med malariaparasitter og derefter lagt i flydende nitrogen, der med en temperatur på -196 Celsius er ekstremt koldt - kunne vi begynde at få nye informationer om hvordan parasitterne arbejder og fungerer, mens de gennem forskellige stadier hærger de røde blodceller hos offeret. Det gav os samtidig en række ideer til, hvordan man på nye måder kan forsøge at sætte parasitterne ud af spillet - blandt andet ved at prøve at designe medicin, der kan sabotere deres system til affaldsbortskaffelse, så de populært sagt drukner i deres eget skrald. Det arbejder vi nu videre med, og på sigt er målet helt klart at kunne bidrage til nye former for malariamedicin - og det er der behov for! Når et middel har været anvendt en tid, begynder der nemlig uundgåeligt at opstå resistens mod det - og så skal der jo nogle andre  midler på banen".

Den videnskabelige undersøgelse, Sergey Kapishnikov og hans kolleger har gennemført, har kun kunnet lade sig gøre, fordi forskerne arbejdede med - og kombinerede resultaterne - fra to forskellige former for avancerede mikroskop-undersøgelser: røntgen-fluorescens og blød røntgenstrålings- tomografi, der blev udført på synkrotron-anlæg i Spanien, Tyskland og Schweiz. Og tilsammen gav de to forskellige undersøgelsesmetoder blandt andet forskerne mulighed for at se hvor i deres eget indre, de skadevoldende malariaparasitter deponerer jern (i form af hæmo-molekyler).

Dette jern, der er meget giftigt og potentielt dødbringende for malariaparasitterne, stammer fra menneskets - offerets - røde blodceller, som parasitterne altså har invaderet, forklarer Sergey Kapishnikov:

Click the picture to see the basic features of the Plasmodium life cycle.

"Parasitterne udvikler sig i offeret, når han eller hun bliver stukket og smittet af en malariainficeret myg, og parasitterne udvikler sig i den indledende fase via et 'ophold' i personens lever. Derefter bliver parasitterne sluppet ud i blodbanen hvor de formerer sig med stor hast i takt med, at de invaderer stadig flere røde blodceller - og bliver der ikke grebet ind rent medicinsk, vil vedkommende til sidst kunne dø".

Mens parasitterne raser, nedbryder de hæmoglobin i de røde blodceller, hvori de sidder - men parasitterne har en konstant udfordring, som de er tvunget til at tage sig af, pointerer Sergey Kapishnikov:

"De skal nemlig skaffe sig af med hæmo - altså jerndelen af det hæmoglobin, de ødelægger - og det er velkendt, at malariaparasitterne løser dette affaldsproblem ved at omdanne hæmo til krystaller. Det betyder, at jernet nu er sluttet inde og derfor neutraliseret, akkurat som hvis man lukkede affald inde i en forseglet container - men der er alligevel  en lang række spørgsmål i forbindelse med denne omdannelse til krystaller, som endnu ikke er videnskabeligt belyste. Derfor udarbejdede vi et særligt analyse-set-up, og ved at studere de inficerede humane blodceller ved hjælp af både røntgen-fluorescens og blød røntgenstrålings-tomografi endte vi med at få 3 D-optagelser af en række detaljer, som ikke har været kendt før. Det gælder både krystallernes placering i parasitterne og visse forhold, som har at gøre med selve krystalliseringsprocessens forløb".

Parasitter i arbejde: Ved at kombinere røntgen-fluorescens og blød røntgenstrålings-tomografi (øverst) kunne forskerne få et detaljeret billede af hvordan malariaparasitter skaber kaos og ødelæggelse i røde blodceller (symboliseret ved æblet i den røde firkant). Illustrationens nederste halvdel viser 'hæmoglobinkredsløbet': Parasitterne, der sidder i centrum af humane blodceller -(her symboliseret ved æblet i den røde kvadrat)- nedbryder hæmoglobin. Parasitterne er imidlertid nødt til at skaffe sig af med hæmo - jerndelen af hæmoglobin - for hæmo er giftigt for parasitterne. Denne bortskaffelse klarer parasitterne ved at krystallisere hæmo - hvorved hæmo forsegles og dermed ikke længere kan skade parasitterne. Forskerne kunne også se konturerne af en proces, der ser ud til at styre den hastighed, hvormed processen forløber. Nu vil de prøve at udvikle medicin, der kan angribe dette feed-back system - for på den måde at kvæle parasitterne i deres egne affaldsstoffer. Illustration: Sergey Kapishnikov

Summen af de observationer, forskerne har gjort, tyder blandt andet på, at krystalliseringsprocessen forløber efter en slags feed-back princip - og hypotesen er, at denne mekanisme styrer systemets hastighed. Herunder den takt, parasitterne fortærer hæmoglobin i - hvilket samtidig må antages at give dem mulighed for at kontrollere, hvor hurtigt det giftige hæmo frigives, forklarer Sergey Kapishnikov:

"Holder hypotesen - og det tror vi, den gør - kan man muligvis hindre malariaparasitten i at overleve ved at ramme denne mekanisme med medicin. Man kunne for eksempel tænke sig, at man arbejdede frem mod præparater, der øger frigivelsen af hæmoglobin i malaria-inficerede røde blodceller hos mennesker så markant, at parasitterne ikke kan nå at krystallisere det. Og så ville parasitterne dø af deres eget, stærkt giftige skidt".

Undersøgelsen har dog også fået forskerne til at kigge i andre retninger - og i samarbejde med kolleger fra USA vil de nu undersøge, om man kan stikke en kæp i hjulet på malariaparasitter ved at manipulere et bestemt protein, der ser ud til at fungere som en slags 'formidler' i overgangen mellem parasitternes udskillelse af hæmo og den  krystallisering af dette gifte stof, de efterfølgende gennemfører, fortæller Sergey Kapishnikov.

Celler på rejse

For at skaffe det nødvendige biologiske undersøgelsesmateriale, inficerede forskerne i laboratoriet humane blodceller, de havde rekvireret i en blodbank, med malaria af typen Plasmodium falciparum - den alvorligste af de fem malariatyper, som kan gøre mennesker syge. Da malariaangrebet havde nået det ønskede udviklingsstadie i testblodcellerne, blev de inficerede celler lynfrosset ved hjælp af flydende nitrogen og undersøgt minutøst - hvorefter otte (8) inficerede enkeltceller blev valgt ud.

Det var celler, som skulle opfylde en række kriterier for at de som planlagt kunne studeres med både røntgen-fluorescens og blød røntgenstrålings-tomografi, forklarer Sergey Kapishnikov: "Cellerne skulle være ubeskadigede, og desuden måtte de ikke være omgivet af et for tykt lag is - vi skulle jo kunne observere malariaparasitterne i blodcellernes indre. Det var noget af et detektivarbejde at finde de otte studie-celler, men nu véd vi, hvordan vi skal spore dem, så fremover vil vi kunne kigge på mange flere celler i vores analyser".

At fragte inficerede blodceller rundt mellem de forskningsinstitutioner, der deltog i arbejdet, kunne i øvrigt være en udfordring i sig selv, erkender Sergey Kapishnikov:

"Eftersom cellerne lige fra det øjeblik de blev udvalgt til forsøget og helt til det var slut konstant skulle opbevares ved -196 Celsius, var det nødvendigt at rejse med dem i særlige beholdere - små topsikrede rør - som igen blev lagt i en cirka 20 kg tung transportkuffert. På et tidspunkt skulle jeg flyve fra Israel til Tyskland med denne kuffert, som jeg vogtede nidkært - og det krævede faktisk en del forudgående papirarbejde at få myndighederne i de to lande til at lade mig henholdsvis gå om bord på maskinen og forlade den igen - med prøvekufferten i hånden".

• Se artiklen på Nature.com >>

Sergey Kapishnikov, Postdoc i forskningsgruppen X-ray and Neutron Science, Niels Bohr Institutet, Københavns Universitet, Tlf. +45 35 33 43 55, Email: Sergey.Kapishnikov@nbi.ku.dk